John Malkovich 1953. december 9-én született az Illinois állambeli Christopherben. Gyermekkorában zárkózott és befelé forduló volt, nem mutatkozott rejtett tehetsége, a színjátszás. A középiskolás évek alatt leginkább a sport és a zene érdekelte. Annak érdekében, hogy népszerűbb legyen, és hogy bekerülhessen az iskola focicsapatába, 30 kilót fogyott tíz hét alatt. A siker kulcsa a „zselés diéta” volt, amely során főleg gyümölcskoncentrátumokat fogyasztott.
Az Eastern Illinois University falai között került kapcsolatba a színművészettel, olyannyira, hogy idővel az összes többi tantárgyát leadta, és csak a színjátszással kezdett foglalkozni. Egy idő után az egyetem adta lehetőségeket kevésnek találta, és a színvonalasabb Illinois State University tanulója lett. Az egyetemi tanulmányai végeztével 1976-ban Chicagóba ment, ahol barátaival csatlakozott a The Steppenwolf Theater Company színházi csoporthoz. A filmes karrierhez az útja több televíziós produkción át vezetett. 1984-ben két nagyobb produkcióban is szerepet kapott, ez volt a True West (1984) és a Hely a szívemben (1984). Előbbiben nyújtott alakításáért Oscar-díjra is jelölték. A hirtelen sikert követően Malkovich számos felkérést kapott, válogathatott a szerepek között.
A Veszedelmes viszonyok (1988) forgatása során szoros viszonyba került Michelle Pfeifferrel, ami nagy botrányt kavart, hiszen Malkovich nős volt. A botrány végül azzal végződött, hogy Malkovich mindkét nőt ejtette, és viszonyba kezdett egy fiatal diáklánnyal, Nicoletta Peyrannal.
Karrierje során számtalan különböző karaktert formált meg. Játszott kasszasikerekben (Con Air - A fegyencjárat, 1998, Transformers 3.: A hold sötétsége, 2011), de kisebb költégvetésű filmekben is feltűnt (A John Malkovich menet, 1999). A potenciális blockbuster jelölt produkciókat elsősorban a pénz miatt, az alacsonyabb költségvetésű filmeket a szakmai kihívás miatt vállalta.
2014-ben szerepet kapott a Crossbones című sorozatban, melyben a legendás kalózt, Feketeszakállat alakította, majd olyan sikerfilmekben és sorozatokban tűnt fel, mint a Zoolander 2 (2016), a Madarak a dobozban (2018), az Űrhadosztály (2020) és a Széttört élet.